Находится на Сергиевской улице, на Анастисиевской горке, ныне уже почти сравнявшейся с окружающей местностью. По местному преданию церковь выстроена в 1377 году тем же самым Василием Долом, который соорудил Васильевскую церковь. Жена и дочь его, будто бы, носили имя Анастасии. Однако, Псковская летопись повествует, что Анастасиевская церковь была поставлена гораздо позже, да и то не каменная, а деревянная, а именно, в 1488 году, во время сильного мора, Псковичи соорудили в один день «церковь деревяную святую Анастасию, на Полонище, на Кузнецкой улице, на Яковлеве посадничьи огороде, на Горке». (Сергиевская улица называлась в древности Кузнецкой. Еще на памяти старожилов местность влево от Сергиевских ворот называлась «Кузнецы»). Следовательно, нынешняя каменная церковь выстроена позже 1488 года, но когда именно – неизвестно. В 1539 году, во время пожара, обрушились церковные своды («верх падеся»). По словам летописи, в 1637 году близ этой церкви совершилось следующее чудесное событие: перед проходившим здесь 12-ти летним мальчиком появился некто «с крилы без ног» и повелел ему сказать жителям, что если они не изменят свою греховную жизнь, то на город обрушится гнев Божий. После сего мальчик был подхвачен как бы сильным вихрем и поднят на воздух выше церковного креста. В 1639 году пристроен придел во имя святой Параскевы. В 1786 году церковь была предназначена к уничтожению, но оставлена.
Храм выстроен на подклетях. Длина его с колокольней 11 саж. 1 арш., ширина 10 с. 1 арш., высота до верхнего карниза 4 саж. На восточной части находятся 3 полукруглые апсиды, из них средняя украшена валиковыми разводами. С севера и юга находятся приделы, из коих южный имеет свою особую апсиду, снабженную обычными Псковскими украшениями. По-видимому, эта апсида пристроена позднее придела, так как ею закрыты трехчастные восточные деления последнего. Северный придел увенчан особой главкой. Купол главного храма имеет репчатую форму с отливом внизу. Паперть и колокольня новые (1819 год).
Внутри церкви находятся четыре круглых столба. Подпружные арки опираются не прямо на них, а на сложенные над столбами особые массивные тумбы. За арками идут коробовые своды.
В начале 1840-х годов церковь обновлена на средства местного благотворителя Ладыгина. Тогда же был сделан и новый иконостас, и написаны художником Денисовым новые иконы. Исполнены они прекрасно, но в западном стиле, а потому производят впечатление скорее картин, нежели икон. Предполагают, что некоторые из этих икон суть портреты членов семейства Ладыгина.
Окулич-Казарин Н.Ф. Спутник по древнему Пскову. Псков, 1913.
Юрий Павлович Спегальский писал о храме Анастасии: «Сохранившееся здание построено целиком в XVI веке. Оно перестраивалось в XVII веке, когда были переделаны первоначальные приделы, и позднее. В 1819 году была уничтожена его звонница и крыльцо и построены существующая теперь паперть с лестничными всходами и колокольня. О первоначальной композиции храма ясно говорит план сравнительно хорошо сохранившегося подцерковья. Храм был совершенно симметричным, с приделами с севера и юга, галереями, притвором и крыльцом перед притвором. С южной и северной сторон к галереям недалеко от приделов примыкали еще небольшие объемчики входов в погреба, помещавшиеся под галереями и приделами. Ход в среднее подцерковье был из-под крыльца.
Окна храма расширены, внутри главное помещение его испорчено сделанной в XIX веке обработкой в духе классицизма (над столбами налеплены подобия дорических капителей с плинтами). Галереи во втором этаже перестроены в XVII веке, причем правый придел был совсем уничтожен, левый же переделан в верхней части (его сомкнутый свод, как и заслуживающая внимания главка с крестом относятся к этому времени). Глава храма – поздней формы (хотя узорный крест ее XVII века). Орнаментация барабана срублена и заштукатурена. У входа в четверик храма обрублен наличник. Несмотря на все эти переделки, можно заметить прекрасные пропорции здания и совершенство его былого интерьера. В XVI веке это была одна из красивейших церквей Пскова».
Вскоре после революции 1917 года церковь святой Анастасии была закрыта. Церковь Анастасии Римлянки находится под охраной как памятник республиканского значения (Постановление Совета Министров РСФСР № 1327 от 30.08.60). В настоящее время храм передан епархии.